5-Aza-CdR对结肠癌细胞增殖及抑癌基因PGDH表达的影响

?656?

肿瘤2008年8月第28卷第8期TumorV01.28,No.8,August,2008

DOI:10.3781/j.issn.1000-7431.2008.08.005

Basic

Research?基础研究

5-Aza-CdR对结肠癌细胞增殖及抑癌基因PGDH表达的影响
李美宁,解军,常冰梅,王莹,兰晓琴,张悦红,程牛亮
(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室,太原030001) [摘要] 目的:探讨5一氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza一2’deoxycytidine,5-Aza—CdR)对SW480细胞生物学行为及15-羟基前列腺素

脱氢酶(15.hydroxyprostaglandin dehydrogenase,PGDH)蛋白表达的影响。方法:5一Aza—CdR处理SW480细胞,通过MTr法、* 板克隆实验观察细胞生长活性的变化,甲基化特异性PCR检测PGDH启动子区的甲基化状态,Western印迹法检测PGDH蛋 白表达改变,并进行细胞周期分析。结果:SW480细胞经5-Aza—CdR处理后,与未处理对照组相比,生长速度出现不同程度减 慢;实验组细胞(不同浓度5和10“moL/L)较对照组细胞的克隆形成率明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);PGDH启动 子区甲基化程度降低,无PGDH蛋白表达的SW480细胞检测到蛋白重新表达。5-Aza-CdR处理SW480细胞后,能够延缓细胞

周期G./S期进程,阻滞细胞于G。期。结论:在结肠癌细胞系中,PGDH基因启动子CpG岛的异常甲基化修饰可能导致其表
达缺失,5-Aza—CdR能够恢复PGDH基因的表达,为结肠癌的去甲基化治疗提供理论依据。 [关键词] 结肠肿瘤;DNA甲基化;5一氮杂.2’一脱氧胞苷;基因表达 [文献标志码]A
the proliferation

[中图分类号]R735.2
Effect of 5-Aza-CdR
sor on

[文章编号]

1000-7431(2008)08-0656-04

of human colorectal carcinoma cell line and expression of tumor suppr髑-

gene

PGDH
Jun,CHANG Bing-mei,WANG Ying,LAN Xiao—qin,ZHANG Yue-hong,CHENG Niu-liang(Department of Medical University,Taiyuan 03000l,China)

LI Mei—ning,XIE

Biochemistry and Molecular Biology,Shanxi

[ABSTRACT]

objective:To explore the effect of 5-Aza-2’一deoxycytidine(5-Aza-CdR)on the molecular biological behaviors of
were

SW480 cells and the expression of 15一hydroxyprostaglandin dehydrogenase(PGDH).Methods:Colorectal carcinoma SW480 cells
treated with 5一Aza.CdR.Cell proliferation tumor suppressor gene PGDH blotting and the cell cycle
was was

determined by MTr

assay

and plate colony

formation

test.The methylation protein
was

status

of the

detected by methylation-specific PCR.The
was

expression of PGDH

measured by

Western
rate

was

analyzed by flow cytometry.Results:It
rate

shown that 5-Aza—CdR decreased the proliferation

of

SW480 cells compared with control group.The clony formation
CdR in 5 and 101mmol/L compared with the control promoter of PGDH gene mcnt induced Gl phase
was

of

SW480 cells decreased significantly after treatment with 5-Aza—

group(35.4%and 26.5%US 59.35%,P<0.01).The methylation degree in the
was

decreased and the expression of PGDH protein of the

detected after 5-Aza—CdR treatment.5-Aza—CdR

treat-
re—

arrest

SW480 cells.Conclusion:The hypermethylation of CpG islands in the promoter of PGDH gene

suits in the loss of PGDH protein expression in human colorectal carcinoma PGDH gene tion
agent

eellline.The

demethylating agent 5.Aza.CdR could

restore

expression.These

findings provide theoretic evidence for clinical treatment of human colorectal carcinoma with demethyla—

5-Aza—CdR. Colonic neoplasms;DNA methylation;5-Aza-2’-deoxycytidine;Gene expression

[KEY WORDS]

Tumor,2008,28(8):656-659

结肠癌是多基因、多步骤的致癌过程,包括癌基 因的激活和(或)抑癌基因的失活等。而在基因的 表达调控中,表观遗传的修饰有着重要作用,主要包 括DNA甲基化修饰和组蛋白乙酰化修饰。DNA甲 基化状态改变是致癌的一个关键因素,是抑癌基因 失活的方式之一…。在癌变过程中使异常甲基化 逆转,特别是癌变早期的转变对肿瘤的防治尤为重 要心J。体外实验已证实甲基转移酶抑制剂5一氮杂一
[基金项目] 山西省科学技术发展计划项目(编号:20060310874)2)

2’一脱氧胞苷(5-Aza一2'-deoxycytidine,5-Aza—CdR)通 过去甲基化作用可使多种CpG岛高甲基化的抑癌 基因重新表达,从而恢复抑癌功能旧1。15一羟基前列 腺素脱氢酶(1 5一hydroxyprostaglandin
dehydrogenase,

PGD日)为新*发现的一种抑癌基因,研究表明该基 因在人类乳腺癌和前列腺癌中存在甲基化异常,结 肠癌中该基因的表达下调,但其机制尚不清楚M刮。 本研究采用5一Aza—CdR对结肠癌SW480细胞株进 行处理,检测PGDH基因表达,并分析肿瘤细胞生物 学行为变化,以期进一步探讨结肠癌的发生机制并 寻找新的治疗方法。

[作者简介]李美宁(1976一),女(汉族).博士,讲师
Correspondence to:CHENG

Niu—liang(程牛亮)

E-mail:chengniuliangty@yahoo.tom

万方数据

第8期.李美宁。等.5-Aza-CdR对结肠癌细胞增殖及抑癌基因PGDH表达的影响

?657?

1材料与方法 1.1材料 1.1.1人结肠腺癌细胞系 院细胞库。 1.1.2主要试剂和仪器5-Aza—CdR购自Sigma公 司,用含NaCl的磷酸盐缓冲液(pH=6.8)配制成储 存液,一70℃保存备用。胎牛血清购自四季青有限 公司,RPMI 1640培养液购自Gibco公司,Wizard
DNA

缓冲液和RNaseA(100 mg/L)50斗L处理,再加入 碘化丙啶(PI,50 mg/L)500斗I.,4。C室温避光放置
30

min,用流式细胞仪分析细胞周期。 MSP甲基化特异性PCR法检测细胞中

SW480购白中国科学

1.2.5

PGDH的甲基化的状态应用饱和酚一氯仿法抽提细 胞基因组DNA,取2斗g DNA溶于45斗L无菌水中, 加入NaOH(3 mol/L)5斗L,37℃作用15 min后,立即 放置冰上,再加入新鲜配制的氢醌(10 mmoi/L) 30斗L,亚硫酸钠(3.6 mol/L,pH=5.0)520肛L, 55℃水浴处理16 h,用Wizard
DNA

Clean.up试剂盒为Promega公司产品,PCR试

Clean—up纯化回

剂盒为TaKaRa公司产品,PGDH抗体购自Cayman 公司,ECL发光试剂购自碧云天生物公司。其他试 剂均为国产分析纯试剂。
1.2方法
1.2.1 RPMI 2

收DNA用于甲基化特异PCR检测。甲基化 (PGDH.M)和非甲基化(PGDH.U)的引物序列如 下:PGDH-M引物序列,上游引物5’.TcGnTrArll’G GTAGGGGAGC-3’,下游引物5 7.TATAAACAAAAAA

细胞培养及分组人结肠癌SW480细胞于 1640(含10%胎牛血清,NaHC03质量浓度为

ArITITllCCGCGA-3’;P∞啊.u引物序列,上游引物5

7一

TG邢ArI[1’GGTAGGGGAGTG-3’;下游引物5’一ATAT
AAACAAAAAAATITrCCACAAC.3’。反应条件:95℃
5 min;950C 30 s、590C 60

g/L,青霉素浓度为100 u/L,链霉素质量浓度为

100¨g/L),370C,C02体积分数为5%的培养箱中 培养。实验时细胞处于对数生长期,活细胞数为 95%~100%。用含1%胎牛血清的RPMI 1640培养 液饥饿培养24 h后,加入终浓度为5、10肛moL/L的 5-Aza—CdR继续培养。每24 h更换为新鲜药液,浓 度同前。连续作用3 d后弃去药液,继续用10%胎 牛血清RPMI 1640培养3 d。以未经药物干预的 SW480细胞作为对照,d 7收集细胞,进行实验。 1.2.2细胞生长曲线上述经药物处理后的细胞 及对照组细胞,用胰蛋白酶消化成单个分散细胞,以 1×104个/mL细胞浓度接种于96孑L板,各组设5个 复孔,共接种6块培养板。待细胞贴壁生长后,每隔
24

s、72℃60 s,40个循环;

72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳,经激光密度扫 描仪采集数据,分析电泳结果。实验重复3次。
】.2.6

Western印迹法检测PGDH蛋白水*的变化

收获细胞(约1×106个)于200恤L细胞裂解液 中,冰上裂解30
min,4。C,12 000

Xg,离心10min,

收集E清液,用Bradford法定量。取50肛g样品与 等体积的2×上样缓冲液混匀,1000C煮沸5
rain,

12%SDS.PAGE电泳分离蛋白。半干式转移至硝酸 纤维素膜,5%的脱脂奶粉室温封闭2 h,加入PGDH

单抗及actin多抗(actin作为对照),所有抗体均用
封闭液按1:500稀释,4℃过夜;PBST洗涤3次, 每次10 min;加HRP标记的二抗,室温反应2 X线胶片曝光。 1.2.7统计学处理所有统计数据采用SPSSl
1.5 h,

h取出1块板,进行MrITI’计数,每孔加20肛L

M1Tr(5 mg/mL),4 h后加入DMSO

100止,室温振

PBST洗涤3次,每次10 min;滴加ECL发光试剂,

荡10 rain,应用酶联免疫测定仪,测波长490 nnl吸 光度D值,连续检测6 d,取*均值绘制生长曲线。 1.2.3细胞*板集落形成实验 于6孑L培养板接 种不同浓度药物处理后的SW480细胞各500个,每 组设3个复孔。370C、CO:体积分数为5%的培养 箱中再静止培养12 d。弃去培养液,PBS洗涤2次,.. 甲醇固定15 min,0.4%结晶紫染色20 rain,流水洗 去染色液,空气干燥。计算每孔的克隆数,50个细 胞以上者为1个克隆,观察细胞形成克隆的大小、数 量和形态。并按以下公式计算克隆形成率:克隆形 成率(%)=*均克隆数/接种细胞数×100%。 1.2.4细胞周期分析 收集5.Aza.CdR作用后的
mL PC

软件进行分析,两组间连续变量比较用t检验,以 元±s表示,多组间连续变量比较用方差分析,P< 0.05为差异有统计学意义。 2结果
2.1

5-Aza—CdR处理前后SW480细胞形态的变化

倒置显微镜下可见未处理的人结肠癌细胞株 SW480呈上皮型贴壁生长,细胞大小趋向均匀,呈 多角形,外观趋向规则,轮廓清楚,细胞间结构紧密, 细胞生长旺盛(图1A)。5.Aza—CdR处理后,与对照 组比较,形态趋于不规则,细胞密度降低,细胞间接

细胞,用70%预冷乙醇固定24 h以上,加l

万方数据

?658?

肿瘤2008年8月。第28卷

触变松,部分细胞皱缩,胞体回缩变圆或脱落呈悬浮 状,颗粒感增强,折光性及贴壁能力减弱(图1B)。

2.4

MSP PGDH基因启动子甲基化分析以研究

对象基因组DNA为模板,经MSP扩增后,其甲基化 和非甲基化扩增产物分别为258和256 bp。SW480 细胞在甲基化抑制剂5一mza?CdR(5 mol/L)作用前, 可见甲基化条带出现,未见非甲基化条带,判定为甲 基化;5-Aza.CdR作用后的电泳结果显示,无甲基化 条带出现,而出现非甲基化条带,判定为非甲基化。 提示5-Aza.CdR逆转了PGDH基因启动子区的甲基 化状态。

图1
Fig.1 The

SW480细胞的形态(×200倍】

morphological alteration of SW480 cells(x 200)

A:5W480 cell;B:10“moL/L 5-Aza—CdR treated SW480 cell

2.2

5-Aza—CdR对SW480细胞增殖的影响

从生
图3甲基化特异性PCR(MSP)结果
Fig.3 Test of PGDH gene promoter

长曲线可以明确观察到5.Aza.CdR处理后细胞生长 速度出现减慢,并与剂量成对应关系,见图2。同 时,*板克隆形成实验表明对照组细胞培养7 d即 可见明显克隆形成,至d 10时克隆数目增多、增大, 周围存在较多散在细胞;而药物处理组细胞于培养
d methylation

state by

MSP

M:100 bp DNA Marker;l:5-Aza—CdR untreated SW480 cell;2:5 “moL/L 5-Aza—CdR treated SW480 cell;M:Hypermethylated product U:Unmethylated product

10时才可见克隆形成,且克隆小、数量少,极少数

散在细胞围绕其周围生长。5-Aza.CdR不同浓度实 验组(5、10 ixmol/L)和对照组的克隆形成率分别为 35.4%、26.5%和59.35%。方差分析显示药物处 理的2组细胞克隆形成率与对照组比较明显降低, 差异有统计学意义(P<0.01),而不同浓度药物处 理的细胞,其克隆形成率差异则无统计学意义(P=
0.056)。

2.5

SW480细胞去甲基化干预前后的Western印

迹法分析结肠癌细胞系SW480为结肠中低分化 腺癌,对5-Aza.CdR作用前后PGDH蛋白测定, PGDH和actin的相对分子质量分别为29
43
X X

103和

103可以明确观察到SW480细胞在5-Aza—CdR
Ixmol/L

作用前几乎没有PGDH蛋白表达,5和10

5-Aza.CdR作用后PGDH蛋白表达的表达量明显高

1.2 -

皇 q

0.8


l 2 3 t硪 4 5 6

于作用前(图4A)。作用后的PGDH蛋白表达条带 密度值与相应actin蛋白条带密度值的比值分别为 18.2±0.51、22.4±0.85,与作用前的比值1.06± 0.19比较,差异有统计学意义(P<0.01,图4B),作 用后的PGDH蛋白条带强度比作用前增加18~22 倍,2个不同浓度实验组之间蛋白表达的差异无统 计学意义。

0.4



图2
Fig.2

SW480细胞经5-Aza-CdR处理后的生长曲线
The growth
curve

of different concentrations of cells proliferation

5-Aza-CdR treated

SW480

2.3流式细胞仪检测细胞周期5-Aza-CdR处理 组(5和10 p.mol/L)细胞G.期分别占58.4%和 68.8%,G2期占12.4%和6.7%,S期占29.2%和 24.5%;而对照组细胞的G,期占43.6%,S期占 38.8%,G:期占17.6%。比较后可见,处理组静止 期细胞所占比例增加,DNA合成期所占细胞比例减 少,提示细胞经5-Aza-CdR处理后分裂增殖能力被 抑制。
图4
Fig.4

5-Aza-CdR处理后SW480细胞PGDH蛋白的表达 Expression of PGDH protein by Western blotting
treated SW480 cell;‘‘P<

l:5-Aza-CdR untreated SW480 cell;2:5斗moVL 5-Aza-CdR treated SW480 cell:3:10斗moVL 5-Aza—CdR 0.01.懈0 pmoVL

万方数据

第8期.李美宁,等.5-Aza?CdR对结肠癌细胞增殖及抑癌基因PGDH表达的影响

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3讨论 表观遗传修饰是基因表达的主要修饰方式, CpG岛的甲基化是其中之一。肿瘤学研究表明, DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖、分化、发育 及基因组印迹等方面起重要作用,并与肿瘤的发生、 发展关系密切uj。与基因遗传机制相同,基因甲基 化状态能够随细胞分裂稳定复制,但甲基化的异常 可以通过药物等作用而改变,因此转变甲基化的异 常模式,对于抑制肿瘤细胞的增殖、诱发分化等具有 重要意义。 甲基化转移酶抑制剂5-Aza—CdR为一种嘧啶类 似物,由对2’.脱氧胞嘧啶第5位碳置换为氮而获 得,与复制过程中的DNA分子结合时,该制剂可与 DNA甲基转移酶I形成共价复合物,抑制该酶的甲 基转移活性,从而导致形成低甲基化的子链,实现去 甲基化功能"J。本实验中选用不同浓度的5-Aza— CdR处理结肠癌细胞株SW480,MTT法检测的细胞 生长曲线可以看出其不同程度抑制细胞生长的作 用;*板克隆形成实验提示,2个不同浓度实验组和 对照组的克隆形成率分别为35.4%、26.5%和 59.35%,统计学分析显示药物处理的2组细胞克隆 形成率较对照组明显降低(P<0.01),同时肿瘤细 胞形态学亦出现相应的改变,显示其活性降低。 FCM分析结果也表明5-Aza-CdR能够抑制细胞增 殖,使细胞周期停滞于G.期。 细胞增殖是受众多基因调控的过程。*年在结 直肠癌中研究证明,前列腺素E2(prostaglandins 长因子受体(epidermal
factor E2,

得以开放,PGDH蛋白得以重新表达。 总之,5-Aza—CdR抑*岢Π┫赴樱祝矗福霸鲋 的机制可能与干扰细胞周期、提高PGDH基因表达 有关。本实验组认为PGDH基因在结肠癌细胞系中 的表达缺失与其启动子CpG岛的异常甲基化修饰 有关,5-Aza—CdR能够恢复PGDH基因的表达,因此 PGDH可能成为结肠癌的一个新的生物学标志和基 因治疗靶点,这也为结肠癌的去甲基化治疗提供理 论依据。但有关PGDH基因的表达调节、转录因子 的作用机制及是否与其他癌基因和(或)抑癌基因 存在相互关联作用还不十分清楚,有待进一步研究。 [参考文献]
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E2 promotes

0,et a1.


PGE2水*受到合成和降解两方面影响,合成的限 速酶为环氧合酶2(cyclooxygenase2,COX-2);而 PGDH是其降解过程中的第一个限速酶010]。PGDH 基因位于4号染色体q34.q35,广泛分布于人和哺乳 动物的消化管、肺、。肾等正常组织中¨1|。实验研究 表明PGDH为抑癌基因,在结肠癌、非小细胞肺癌、 乳腺癌和甲状腺髓样癌中表达缺失或减少,而且是 肿瘤发生的早期事件,与多种恶性肿瘤的发生发展 密切相关H屯12j。本实验利用5一Aza—CdR作用无 PGDH蛋白表达的SW480细胞,利用MSP方法检测 发现PGDH基因启动子区存在甲基化,并且该药物 能成功逆转PGDH启动子区甲基化状态,使该基因

colon

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involved

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[收稿日期]2007-09-25 [本文编辑]李明烈

万方数据


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